【Merck & Millipore】Amicon? Ultra超濾管

——超濾法制備外泌體

截留精準 高回收率

讓樣本制備如此簡單

用膜進行樣品處理的好處很多, 如操作簡便, 效果穩(wěn)定可靠, 成本效益高等。超濾的性能依賴于對膜孔徑規(guī)格的嚴格工藝控制。超濾膜可截留1-1000kDa 的分子,鹽和水等小分子會透過,因此在大分子樣品處理中得到了廣泛應(yīng)用,包括截留樣品的純化、濃縮,及流穿樣本的處理等。

  默克Amicon? Ultra超濾管采用低蛋白吸附的Ultracel? 再生纖維素超濾膜,確保更精準的截留分子量和更高的蛋白回收率。因其優(yōu)異的性能,Amicon? Ultra超濾管已被廣泛應(yīng)用于多種樣品制備的場景,包括蛋白/抗體/酶/核酸等生物樣本的濃縮、脫鹽和緩沖液置換、病毒/嗤菌體/外泌體/囊泡/微粒等樣本的純化、藥物篩選、藥物結(jié)合實驗、蛋白富集、小分子物質(zhì)去除、分析樣品前處理等,為科學(xué)研究提供高效的創(chuàng)新方案。

Amicon? Ultra 超濾管的獨特優(yōu)勢:

? 高回收率: 超濾膜的截留精準,非特異吸附低,>90%回收率

? 不易堵塞: 雙側(cè)豎膜設(shè)計,不易堵塞,提高效率

? 避免污染: 熱封技術(shù),無粘合劑,防止溶出物污染

? 性能穩(wěn)定: —體化設(shè)計,合理死體積,數(shù)據(jù)平行性、重現(xiàn)性好

? 廣泛兼容:  pH 3-13適用,化學(xué)兼容性好

Tips  “就地取材”快捷制備外泌體

外泌小體(Exosome)是—種囊泡結(jié)構(gòu),直徑通常在30-150nm,常見于正常體液和病理樣本,培養(yǎng)細胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體,其運載的蛋白和核酸涉及其細胞間物資、信息交流,影響和調(diào)控著多方面的生理功能,包括腫瘤發(fā)生、免疫促進、渦亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)及發(fā)育和分化等。由于在體液中出現(xiàn),外泌小體對于臨床生物標志物檢測特別有利,成為體外診斷、biomarker研究的新熱點。

近年來隨著分離純化技術(shù)的提高,關(guān)于外泌小體的研究成果頗豐;這進—步吸引了越來越多領(lǐng)域的課題將外泌體納入研究對象。研究的前提是方便、高效、標準化地分離純化外泌小體。經(jīng)過近20年的化外泌小體。經(jīng)過近20年的探索,已經(jīng)建立了超速離心法、沉淀法、色譜法、親和純化法等。在大量實踐中大家逐漸認識到根據(jù)下游研究對樣品的要求,以及起始樣品的規(guī)模、數(shù)量,可以選擇不同的外泌體制備策略。因不需要特殊的設(shè)備和試劑盒,對操作人員也沒有特別的經(jīng)驗要求,超濾法后來居上,成為實驗室中制備外泌體的通用方法。 

參考方案

兩步法細胞上清的外泌體分離

操作步驟舉例

從細胞培養(yǎng)上清中制備外泌體

步驟一: 樣品澄清

1. 將培養(yǎng)基上清從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中

2. 旋緊 Steriflip? 組件(貨號 :SCGP00525,0.22μm, PES膜)至樣品管頂部,打開樣品管末端

3. 倒置組件并固定在基座或架子上

4. 將調(diào)節(jié)真空源連接到Steriflip? 裝置側(cè)面的真空端口上。打開真空使溶液通過膜進入空管。

5. 拆下Steriflip? 裝置并蓋上樣品。將過濾后的樣品保存在 4°C 或進行囊泡富集。

   本離心超濾方案基于使用AU-15 超濾管(10 kDa MWCO, # UFC901024)處15 mL樣品。如果要使用不同的體積或超濾管規(guī)格(AU-0.5,AU-2或AU-4 mL),請參閱相應(yīng)的Amicon? Ultra 超濾管使用說明書。

步驟二: 超濾管平衡 

6. 向超濾管中加入2ml PBS,蓋上蓋子,在4,000xg的擺桶轉(zhuǎn)子中離心10分鐘。

? 對于AU-2和AU-4,可以使用相同的離心機轉(zhuǎn)速。如果要使用固定角度轉(zhuǎn)子,請查閱設(shè)備用戶指南以獲得適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速和體積限制。

? 對于AU-0.5,樣品在可容納1.5 mL管的固定轉(zhuǎn)子中以14,000xg離心。

7. 移去超濾裝置底部未過濾的PBS,抽取收集管里的濾液

? 對于AU-2、AU-4和AU-15,可通過移液器去除濾液。

? 對于AU-0.5,可1000xg反轉(zhuǎn)離心2分鐘去除濾液,移除收集管中PBS或更換新的收集管。

步驟三: 樣品超濾     

8. 像AU-15超濾管中加入15ml 樣品,蓋上蓋子

9. 4,000xg離心30分鐘。

備注: 終產(chǎn)品體積通常大約500μL(30倍濃度),但根據(jù)樣品的性質(zhì)、流速和離心時間可能會有所不同。有關(guān)樣品體積和終體積的估計,請參閱對應(yīng)Amicon?Ultra超濾管使用說明書。

10. 從離心機上取下超濾裝置,棄除收集管里的液體。

11. 往過濾裝置中加入14mL PBS,移液器輕輕吸吐多次。4,000xg離心30分鐘。

12. 從過濾裝置中回收濃縮樣品。

? 對于AU-2、AU-4和AU-15,可用移液器吸取樣品,并多次沖洗膜側(cè)壁(每側(cè)3-4次)以確保完全回收。

? 對于AU-0.5,將過濾器倒扣在干凈的離心管中。在2000xg下離心1分鐘,將樣品轉(zhuǎn)移到試管( 反向旋轉(zhuǎn) )。

13. 細胞外囊泡樣品準備好進行分析。

注意事項及補充提示

? 無血清樣品選擇3kDa孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率。

? 有血清樣品選擇100kDa/500kDa孔徑是為了盡可能去除細胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響。

? 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度,以及需要制備的目標外泌體/囊泡/顆粒的大小分布來選擇和優(yōu)化超濾孔徑(3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa),以便達到更好的得率和操作體驗。

? 樣品體積大于30mL時可以考慮用超濾杯或Centricon plus-70超濾管,請注意攪拌式超濾杯在200mL以內(nèi)時吸附損耗可能較離心式超濾管略偏高。

? 如需進—步提高特定外泌體的純度,可選用包被相應(yīng)抗體的磁珠進行親和純化精制。

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4個SH-SY-5Y 細胞系的外泌小體樣品(含或不含血清)

不同方法制備外泌小體產(chǎn)量比較